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NML封面文章 | 用于淋巴结转移灶靶向和光热治疗的靶向性酞菁胶束

已有 725 次阅读 2021-10-12 08:21 |系统分类:论文交流

Targeted Micellar Phthalocyanine for Lymph Node Metastasis Homing and Photothermal Therapy in an Orthotopic Colorectal Tumor Model

Hai-Yi Feng, Yihang Yuan, Yunpeng Zhang, Hai-Jun Liu, Xiao Dong, Si-Cong Yang, Xue-Liang Liu, Xing Lai, Mao-Hua Zhu, Jue Wang, Qin Lu, Quanjun Lin, Hong-Zhuan Chen, Jonathan F. Lovell, Peng Sun*, Chao Fang*

Nano-Micro Letters (2021)13: 145

https://doi.org/10.1007/s40820-021-00666-8

本文亮点
1. 采用表面活性剂剥脱法制备了小尺寸曲妥珠单抗靶向胶束(T-MP),胶束内核浓缩了酞菁染料,可产生很强的近红外光热效应

2. 与非靶向IgG偶联的胶束相比,T-MP在原位结肠癌模型的淋巴结(LN)转移灶中集聚更多

3. 在手术切除原发肿瘤后,用T-MP微创光热治疗转移性LN,显著延长了小鼠的生存期

内容简介
淋巴结(LN)转移严重影响肿瘤治疗预后。研究表明,粒径小于50 nm的纳米粒静脉给药后可渗透进入LN转移灶中。同时,与非靶向纳米载体相比,靶向肿瘤细胞的纳米载体可在实体瘤的原发灶中集聚更多,从而提高治疗效果。因此,我们推测通过赋予小于50 nm的纳米载体对肿瘤细胞的靶向性,有望增强纳米载体在LN转移灶中的积累,并为LN转移灶的局部治疗(如光热治疗)提供更大的益处。上海交通大学医学院方超/孙鹏课题组采用独特的表面活性剂剥脱方法,制备了曲妥珠单抗修饰的酞菁胶束(T-MP<50 nm)。T-MP具有很好的光热转换功能,可靶向性光热消融过表达HER2的HT-29结肠癌细胞。与非靶向胶束相比,T-MP在原位结肠肿瘤肠系膜LN转移灶中集聚更多,且在手术切除原位肿瘤后,用T-MP微创光热治疗转移性淋巴结,显著延长了小鼠的生存期。其治疗效果与传统的淋巴结切除术相当甚至更好,而后者通常会导致手术创伤和术后并发症。研究结果首次证明,靶向性小尺寸纳米粒子有望成为治疗LN转移的新范式。
图文导读
I 靶向胶束酞菁(T-MP)的制备和表征
Pluronic F127是一种FDA批准的广泛用于药物递送的非离子共聚物,本文采用表面活性剂剥脱方法制备酞菁胶束,且对F127的末端羟基通过与琥珀酸酐反应而羧基化从而修饰具有靶向功能的曲妥珠单抗,得到T-MP。对其进行理化特性的表征,考察光热转换和光声成像性能。

图1. VBPc胶束的表征。(A) MP(未修饰)和T-MP的TEM图像。由动态光散射(DLS)确定的粒径(B)和zeta电位(C)。(D) 游离抗体和T-MP的考马斯蓝染色(左)和近红外荧光成像(右)。(E) 二氯甲烷中游离VBPc和水中MP的Vis-NIR吸收。(F) 在2 W/cm2下,T-MP的VBPc浓度依赖性升温。其中插图为5 min时的代表性光热图像。(G) T-MP (20 μg/ml VBPc) 的光功率依赖性升温。其中插图为5 min时的代表性光热图像。(H) 辐照时间对T-MP的Vis-NIR 吸收曲线的影响。(I) 在2 W/cm2的808 nm照射下激光诱导加热T-MP (VBPc 20 μg/mL) 的连续循环。(J) T-MP的光声(PA)成像特性。数据表示为平均值±标准差。(n=3)。

II T-MP在HT-29细胞中的增强摄取和光热细胞毒性

HER2是多种癌症的临床相关治疗靶点,包括乳腺癌、胃癌和肺癌。并且HER2与结直肠癌的进展有关,针对结直肠癌的抗HER2治疗正在进行临床试验。本研究通过对13名结直肠癌患者的肿瘤组织进行免疫组织化学分析发现,肿瘤细胞中的HER2表达高于肿瘤基质和邻近正常组织中的表达。这些观察结果表明 HER2受体可能是临床相关的靶标,适合用于结直肠癌靶向药物递送。HT-29-luc是一种具有强HER2表达的人类结直肠癌细胞系,利用该细胞系进行胶束的摄取研究发现,与非靶向同种型IgG偶联胶束(nonT-MP)相比,曲妥珠单抗修饰(T-MP)以时间依赖性方式将细胞摄取提高了2~4倍。这种效应会导致对HT-29-luc的光热细胞毒性显著增强。

图2. 靶向细胞摄取和提高光热诱导的细胞毒性。(A) 与人类正常结肠组织相比,代表性免疫组织化学染色显示人类患者结肠癌中的HER2高表达。(B) HT-29细胞中HER2表达的蛋白质印迹分析。#1、#2 和 #3为三个重复样本。(C) HT-29-luc细胞在与iFluor 594标记的胶束(Ex 563 nm,Em 604 nm)孵育1 h和4 h后细胞摄取的共聚焦荧光图像。(D) 通过ArrayScan XTI高内涵系统分析的HT-29细胞中的iFluor 594荧光强度。(E) 图示显示了靶向抗体修饰改善的细胞摄取如何增强光热诱导的细胞毒性。(F) 用胶束和激光照射处理后的细胞活力。(G) Calcein AM/PI共染色HT-29-luc细胞经过各种处理后的荧光显微镜图像。活细胞和死细胞分别以绿色(Calcein-AM; Ex 490 nm, Em 515 nm)和红色(PI; Ex 530 nm, Em 580 nm)显示。数据表示为平均值±标准差。(n=3)。*p <0.05,**p <0.01,***p <0.001。

III 原位结直肠癌模型构建和转移淋巴结中T-MP的靶向集聚

将肿瘤细胞注射到盲肠浆膜下层,建立原位HT-29-luc结肠癌模型。病理和免疫组织化学分析表明,可检测到的淋巴转移通常为单发病灶,且位于LN皮质区域。原位和离体生物发光和荧光成像显示,静脉注射的Cy5.5标记的T-MP可成功靶向转移性肠系膜前哨LN。进一步考察了转移性淋巴结中T-MP的时间依赖性分布。T-MP的积累随着时间的推移而增加,并在注射后8 h达到峰值。T-MP在转移性前哨LN中的靶向效果显著优于非靶向nonT-MP,分别在4 h和8 h表现出2.2倍和4.4倍的分布增加。

图3. 原位HT-29-luc结肠癌模型构建和T-MP对转移性LN靶向。(A) 通过在盲肠中浆膜下注射肿瘤细胞(I)建立原位HT-29-luc肿瘤。2周后肉眼可见实体瘤(II)。(B) 苏木精和伊红(H&E)染色显示原位肿瘤的正确解剖位置。(C) 肠系膜中转移LN的图示。(D) 静脉注射的Cy5.5标记的T-MP成功靶向转移性肠系膜前哨LN。(I) 小鼠腹腔中原位HT-29-luc肿瘤的图示。(II) 原位肿瘤和转移LN的生物发光和荧光成像。(III) 肿瘤切除后转移性LN的生物发光和荧光成像。(IV) 切除的转移性LN的离体成像。(E) 转移性LN中Cy5.5标记胶束的时间依赖性离体成像。(F) 图E中荧光强度统计。(G) 转移性LN中的VBPc含量。数据表示为平均值±标准差。图F中n=3,图G中n=5。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.01。

IV 转移性LN中胶束的微观分布以及光声定位

本文为了进一步研究胶束在转移LN中的分布特征,对转移性淋巴结进行了免疫荧光染色,发现胶束主要分布在肿瘤细胞转移区,且T-MP在转移区的积累比非靶向nonT-MP胶束高3.0倍。同时,两个胶束在LN非转移区的低分布量没有显着差异。此外光声(PA)成像还显示,与非T-MP相比,转移性LN中T-MP的PA 信号更强(约6倍)。注意到PA信号在LN中分布不均匀,而是在一侧分布更多,这种现象与转移灶位于LN的外周皮层区域的观察结果一致。

图4. 转移性LN中胶束的微分布及PA定位。(A) 静脉注射T-MP或nonT-MP后8 h转移性LN的免疫荧光染色。胶束用Cy5.5(红色)标记,转移性肿瘤细胞用兔抗HER2抗体和FITC二抗(绿色)染色。有转移的区域(1和3)和无转移区域(2和4)在图B中被放大。(C) 定量图B中的荧光强度。(D) 切除的转移性 LN的体外PA成像以及信号强度统计。数据表示为平均值±标准差。(n=3)。**p<0.01,***p<0.001。

V 转移性淋巴结的光热治疗和抗肿瘤功效

我们接下来研究了T-MP对转移性LN的光热疗效。对HT-29-luc荷瘤小鼠静脉注射T-MP或nonT-MP (5 mg/kg VBPc) 8 h后,手术切除原位肿瘤,用808 nm激光(2 W/cm2, 10 min)照射转移性LN,消融转移性肿瘤细胞。发现注射T-MP的转移性LN的温度从27.3℃增加到 54.3℃,明显高于用nonT-MP处理的对照温度(46.5℃)。48 h后,将照射过的转移性LN切除并用电子显微镜观察。与nonT-MP组相比,T-MP光热疗法的转移性淋巴结中观察到更多以细胞收缩、核破裂和固缩为特征的死亡肿瘤细胞。同时,通过监测肿瘤的生长复发和小鼠的存活率发现,与nonT-MP相比,当用T-MP辅助激光照射治疗转移性淋巴结时,肿瘤复发受到显著延迟和抑制,且小鼠的生存期显着延长(中位生存期为96天)。这种治疗结果与肿瘤切除加淋巴结清扫术的传统治疗的效果相当甚至更好,后者获得了91天的中位生存期,证明了这种局部微创治疗的优势。

图5. 转移性LN的光热疗法和抗肿瘤效果评估。(A) 图示在第0天对原位肿瘤的手术切除肿瘤并光热治疗转移LN。(B) 使用Testo 890热成像仪记录转移性LN的光热升温。(C) 光热治疗后LN的TEM图像。(D) 肿瘤切除前(第0天)以及肿瘤切除和光热治疗后小鼠的生物发光成像。(E) 图D生物发光强度统计。(a) T-MP+激光 vs. nonT-MP+激光;(b) nonT-MP+激光 vs. T-MP、nonT-MP和肿瘤切除术。(c) T-MP+Laser vs. 除nonT-MP+Laser之外的所有其他对照。(F) 小鼠的生存曲线。(G) 小鼠体重。数据表示为平均值±标准差。(n=5)。*p<0.05,**p<0.01和***p<0.001。

作者简介

方超

本文通讯作者

主要研究领域

主要从事肿瘤靶向递药系统研究。

主要研究成果

上海交通大学医学院教授,博士生导师,癌基因与相关基因国家重点实验室PI,上海交通大学医学院虹桥国际医学研究院PI。代表性成果在Adv Sci、Adv Funct Mater、Nano Lett、Small、ACS Nano等发表,申请和授权发明专利14项(PCT专利1项),主持国家自然科学基金项目6项。

Email: fangchao32@sjtu.edu.cn

孙鹏

本文共同通讯作者

主要研究领域

胃肠道肿瘤淋巴转移治疗的基础和临床研究、胃肠道肿瘤围手术期加速康复外科措施的管理和实施。

主要研究成果

上海交通大学医学院附属同仁医院普外科主任医师、行政主任,上海市医学重点专科学术带头人。近年来专注于术中荧光导航淋巴结清扫技术的临床转化,完成荧光导航下的胃肠道肿瘤淋巴结清扫手术百余例。研究成果在J Hepatol、Hepatology等期刊上发表。

Email: sp2082@shtrhospital.com

冯海一

本文第一作者

上海交通大学医学院 博士后

主要研究领域

肿瘤淋巴靶向治疗递药系统。

袁一航

本文共同第一作者

上海交通大学医学院 博士研究生

主要研究领域

胃肠道肿瘤靶向治疗的纳米技术研发。

撰稿:原文作者
编辑:《纳微快报(英文)》编辑部
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