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科学插图有新意:植物甾醇生物降解可高浓度积累9--OH-雄烯二酮的生物技术

已有 1491 次阅读 2021-2-28 18:27 |个人分类:科技评论|系统分类:科研笔记

科学插图有新意:植物甾醇生物降解可高浓度积累9alpha-OH-雄烯二酮

          杨顺楷     四川   成都

如何用比较直观的图像,将国内比较前沿,由科学期刊报道的科学研究论文内容,在本网展示给有兴趣的网友观看,以起到沟通科普的作用。这里向读者介绍《应用与环境生物学报》2020,26卷4期封面的插图,它将该期卷头条论文“耻垢分枝杆菌中3-甾酮-C1,2脱氢酶对植物甾醇转化积累9alpha-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的影响”(P.739)比较形象地展现给读者。该分枝杆菌菌株,经由对3种A环C1,2-位-3酮甾体脱氢酶的同功酶酶基因的分子改造,使用了先进的CRISPR-Cas12a 辅助重组技术,成功地构建了失活3种分枝杆菌A环C1,2位-同功酶的菌株。这就使得如图示中的两种植物甾醇底物分子,即左上方的豆甾醇和左下方的谷甾醇分子,显示已经进入和尚未进入分枝杆菌细胞内被生物降解的过程。降解首先从植物甾醇侧链经由beta-氧化机制脱掉2个碳,直到生成具有四环结构的C17- 酮甾体化合物,即通常说的4AD,ADD,以及9alpha-OH-AD,可见细胞内左侧的3个甾体化合物。目前追求的生物降解目标是能够稳定高浓度积累9alpha-OH-AD,而右侧图示就是经过分子改造,失活了所有3,17-酮基甾体脱氢酶的重组分枝杆菌细胞发酵转化的结果。当然,4AD,ADD也是很有用的转化产物。


在此,首先须得提到一个医药化学工业中常用到的缩略字API(active pharmaceutical ingredient)或用复数APIs。在甾体激素药物生产中,就是称为前体或中间体,我国作为甾体激素药物生产大国,有企业数百家,近年出口的多种APIs 每年高达10亿美元,数量达千吨级水平,确实为全球的甾体激素药物产业发展作出了重要贡献。


国内甾体激素药物APIs的转型发展,基本上从进入新世纪已经开始。原有基于薯蓣皂素—双烯醇酮的半合成路线,已经因为国内资源耗尽而不可持续,不得不转型开辟新甾体激素药物APIs半合成路线。由植物甾醇(植物油脂工业副产品,木材纸浆工业副产品妥尓油),经过利用放线菌目的细菌偶发分枝杆菌,发酵生产得到的3个重要的甾体API产品,即雄烯二酮(4AD),1,4-脱氢-雄烯二酮(ADD),以及称为微生物甾体转化第二次重要突破的API产品,9alpha-OH-雄烯二酮(9-OH-AD),所替代。


为什么称9alpha-OH-AD是第二次甾体微生物技术突破?自然会联想起上世纪五十年代初期治疗风湿关节炎“神药”可的松的发明。首次霉菌对孕酮的11alpha- 羟基化,以及对化合物S的11beta- 羟基化;前者合成产可的松/强的松,后者产出氢化可的松/泼尼松龙。由植物甾醇生物发酵转化产出的另外一个中间体雄烯二酮(4AD)作为中间体,如果用来合成糖皮质激素,缺乏用化学法不可能实施的在C11位引入氧原子,还是须得借助霉菌发酵氧化引入氧功能基;而9-OH-AD正好就提供了这一化学法引入11位氧原子的立足点,即利用化学合成的磺酯化脱酯完成向复杂的9-OH-AD脱水反应,而成为可以避开由孕酮或环氧孕酮的霉菌发酵氧化引进C11-位羟基化生物工艺,较为成功地获得烯键C9(11)-AD的要求,具有很好的半合成路线的技术经济性。


对上述甾体激素药物半合成路线的历史发展,不得不追溯到美国普强制药公司等早期的创新发明过程。提出两种开发策略,其一就是借助美国丰富的大豆植物甾醇资源,建立起大规模的逆流分配技术,成功分离出豆甾醇组份,化学法合成孕酮,再由孕酮进行霉菌发酵转化为11alpha-孕酮,直到产出可的松和泼尼松;其二由孕酮合成化合物S,再经由新月弯孢霉生物转化产出氢化可的松和泼尼松龙。


这两种方案在普强制药公司反复比较研究开发实施了25年,为了解决大量丢弃未得以利用的谷甾醇废料堆。该公司正式启动对谷甾醇的生物学技术研究始于上世纪70年代早期,即利用传统的工业微生物学育种技术—突变株降解甾醇的筛选。结果得到一株由偶发分枝杆菌变异的突变体,成功实现对谷甾醇侧链降解,并且又实现对雄烯二酮9位的Alpha-羟基化,积累起技术经济可行的API,9alpha-OH-AD。用它合成产出高效含卤(氯,氟)糖皮质激素,具有很好的技术经济性。稍后开发出利用墨西哥量大价廉的薯蓣皂素-双烯半合成路线,自然甾体激素药物的研发路线易于同普强制药等公司的已经储备的技术基础合理整合,易于由薯蓣皂素半合成路线替代,以至于后来70年代墨西哥大幅度提高薯蓣皂素出口价格,也对美国数家甾体激素药物公司没有多大影响。

后来,80-90年代,直到新世纪,均由我国大量开发利用国产薯蓣皂素植物资源,经由薯蓣皂素-双烯路线生产大量廉价的APIs,除了少量供国内生产甾体激素药物外,大量出口欧美有关甾体激素药物制药公司,由它们加工制造高端甾体激素药品在世界范围内销售药品。


目前,我国的甾体激素药物研发水平,经过数代科技人员和制药企业的努力,也已经达到或接近世界先进水平,深度开发前景很好。





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